CAR-T细胞疗法在恶性血液病中显示出令人印象深刻的疗效。去年，FDA批准了两种针对CD19的CAR-T细胞疗法。诺华的tisagelecleucel(Kymriah)用于白血病(2017年8月)和淋巴瘤(2018年5月)，Kite Pharma的Axicabtagene Cioleucel (Yes Carta)用于淋巴瘤(2017年10月)。
这也促进了在实体瘤中具有类似疗效的CAR的发展。然而，在这一过程能够达到足够的功效之前，它仍然面临许多必须解决的挑战：
在实体瘤CAR-T细胞治疗的诸多挑战中，一个主要障碍是缺乏真正的肿瘤特异性靶抗原，这迫使细胞免疫学家靶向肿瘤中过度表达的肿瘤相关抗原(TAAs)。但TAAs在正常组织器官中也有表达，因此存在安全风险。
此外，实体瘤的肿瘤微环境(TME)，尤其是免疫抑制剂，阻止了有效的抗肿瘤免疫反应。免疫抑制TME包含许多成分，包括物理屏障，如致密的细胞外基质；功能失调的上皮细胞；代谢点，比如缺氧；免疫屏障，如免疫抑制细胞因子/分子和免疫抑制免疫细胞。
近日，CAR-T领域的“大牛”美国宾夕法尼亚大学的Carl June教授发表了《免疫学前沿》最新综述，指出要有效靶向实体瘤，需要同时解决影响疗效和毒性的各种因素，深入了解CAR-T细胞生物学和影响CAR-T细胞治疗治疗窗的各种因素。
在这篇综述中，Carl June等人总结了CAR抗原识别机制的最新发现，还讨论了调整和扩大治疗窗口的合理策略，以便CAR-T细胞能够有效和安全地靶向实体肿瘤。
或许，它能给你一些有用的信息，让你在实体瘤CAR-T细胞治疗中苦苦挣扎。
CAR-T细胞生物学基础知识
虽然T细胞与靶细胞通过TCR相互作用的基本机制已经得到深入研究，但CAR与靶细胞相互作用的机制仍不清楚。它由CAR TCR复合物和抗体组成。因此，讨论CAR与内源性、未修饰的TCR-T细胞之间的相似性，并定义CAR的明显差异，可以更好地理解CAR-T细胞的生物学。
（同tracer）曳光弹
由TCR和TCR亚单位组成的异二聚体。每个亚单位包含一个可变区(V)和一个恒定区(C)，随后是一个跨膜区。每个V结构域包含三个互补决定区(cdr)，它们与主要组织相容性复合体(MHC)上的肽相互作用。
TCR本身没有信号结构域，所以需要CD3复合物启动细胞内信号转导。CD3复合物由三种二聚体组成，即CD3、CD3异二聚体和CD3同二聚体。
汽车
将合成的嵌合蛋白引入T细胞，以重定向抗原特异性并增强细胞功能。一般来说，CAR由单克隆抗体的单链可变片段(scFv)、细胞外间隔区(称为铰链)、跨膜结构域、CD3信号结构域和通常一个或两个(第二或第三代)共刺激结构域组成。
非典型构建的CAR以受体配体或多肽作为细胞外抗原识别域，如zetakine CAR:白细胞介素-13受体2(IL13R2)zetakine CAR。
给予CAR T细胞通过scFv(抗体识别)以不依赖MHC的方式直接结合表面抗原的益处。CAR可以同时通过CD3和共刺激结构域向T细胞传递信号，可以诱导T细胞的化学计量和潜在的理想活化。
CAR是如何触发免疫突触形成和信号传递的？
免疫突触由TCR和CAR形成。
TCR是
t细胞活化是由TCR和MHC-肽复合物(称为IS)之间高度组织化和动态的相互作用介导的。成熟的IS是基于TCR信号的聚集，诱导T细胞应答。
由三个同心分子环组成(图A):
IS的内环被称为中央超分子激活簇(cSMAC)，TCR信号在其中发生。CSMAC包含大多数TCR-MHC-肽复合物、CD28、PKC-和Lck。
外周SMAC(pSMAC)含有参与细胞粘附的蛋白质，如整合素LFA-1、细胞骨架连接蛋白talin和ICAM 1；
大分子，如CD43和CD45，被pSMAC排除，构成远端SMAC(ds MAC)；
溶解颗粒的分泌发生在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)和靶细胞之间的IS变体(即分泌突触)中。分泌突触在cSMAC中有两个独立且不同的结构域：含有信号蛋白的信号转导结构域；(2)与细胞因子、穿孔素和颗粒酶的胞吐作用相关的分泌结构域。Stinchcombe等人证明了Lck信号控制的瞬时极化和中心体与质膜的对接在指导这种分泌的机制中起着重要作用。
此外，抑制和共刺激分子，如PD-1，CTLA-4和ICOS，也聚集在IS区，并在调节T细胞活化中发挥关键作用。
汽车是
尚未广泛研究CAR下游的细胞内信号转导和由CAR形成IS的机制。
已经证明，在CD19特异性CAR-T细胞和靶细胞之间，ZAP70被募集到IS，CD45被排除在IS之外，类似于TCR激活。自体CD19 B细胞激活CD19特异性CAR-T细胞后，TCR的下游信号分子如CD3、LAT、Lck和ZAP70被磷酸化。与第二代CAR-T细胞相比，第三代CAR-T细胞在TCR下游信号分子上具有显著更高的磷酸化状态。
CAR IS(图B)在结构上不同于TCR IS。CAR没有显示出系统的靶眼结构，这是TCRI的一个显著特征。CAR的肌动蛋白环组织不良，在CAR的中心肌动蛋白可能不会完全消失。LFA-1紊乱时，CAR肿瘤抗原复合物在CAR中形成随机分布的微团簇。
TCR IS形成靶眼结构需要5-10分钟，而CAR IS可能不需要形成这些稳定的结构，因为CAR IS的无组织多焦模式足以快速诱发显著的近端信号传递，这种传递发生在短时间内(2分钟)。
IS生物学的另一个重要部分是将细胞毒性颗粒(包括穿孔素和颗粒酶)递送至由微管组织中心(MTOC)介导的IS。CAR的近端信号快速但持续时间短，也诱导MTOC快速迁移到IS，加速粒子的输送。
虽然CAR IS的机制已逐渐显现，但尚不清楚CAR IS结构的差异是否与CAR-T细胞的功效有关。
CAR的可溶性配体，如CD30、间皮素、CEA等，以单体形式存在时不能触发CAR信号，因为它们不会引起CAR的二聚化。然而，CAR-T细胞可能识别以寡聚体形式存在的可溶性配体，如TGF-，即使没有细胞间相互作用。
CAR-T细胞识别的目标密度阈值是多少？
为了解决CAR激活阈值的问题，Watanabe等人研究了激活CD20特异性CAR-T细胞(CD28共刺激结构域)所需的CD20密度，其中每个靶细胞表达约200-250，000个CD20分子。细胞中表达最低密度CD20(约200分子/细胞)的靶细胞可被CAR-T细胞诱导裂解。这一数据与之前的报道一致，即CAR针对小鼠OTS8的肿瘤特异性糖表位，可裂解具有相似低密度(~200分子/细胞)靶抗原的靶细胞。
Watanabe等人也证明了诱导T细胞增殖和细胞因子产生所需的靶抗原密度高于诱导CAR介导的裂解所需的靶抗原密度。
总之，CAR-T细胞可以识别靶抗原水平相对较低的靶细胞，并且它们对细胞裂解、增殖和个体细胞因子产生具有分级的T细胞信号阈值。CAR构建体(例如，scFv、铰链、共刺激结构域的亲和力)或CAR表达密度的差异可用于更精确地控制CAR-T细胞的活化。
CAR-T细胞可以当连环杀手吗？
内源性T细胞和NK细胞可以连续分裂多个靶细胞(连环杀伤)，这大概是根除肿瘤所必需的。然而，直到最近，CAR-T细胞介导持续杀伤的能力和靶细胞裂解的动力学已被完全证实。
Davenport等人使用一种新的转基因小鼠模型来测试由内源性TCR或异位表达的CAR激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的功能。他们使用延时视频显微镜清楚地证明了CAR-T细胞是连环杀手。约22%的CAR-T细胞依次对两个或三个肿瘤细胞进行致命打击，CAR持续杀伤的频率与TCR相当。
细胞裂解的动力学分析显示，TCR和CAR在最初20小时内介导相同的裂解动力学。然而，与TCR介导的裂解相比，20小时后，CAR介导的细胞裂解动力学变慢。这种差异可以用抗原识别刺激后CAR的下调来解释，这种下调可以通过基于TCR的CAR表达来改善。
汽车亲和力如何影响T细胞功能？
t细胞活化受TCR和MHC-肽复合物相互作用的调节，影响活化敏感性的主要因素是靶抗原密度和TCR亲和力。肿瘤在微环境中的主要免疫抑制机制是抗原识别失败，这是由于低亲和力TCR与肿瘤相关肽-MHC复合物的相互作用。
TCR对自身衍生肽(如肿瘤抗原)的亲和力低于TCR对病原体衍生抗原的亲和力。因此，通常更难分离出对TAA足够敏感的T细胞，这是过继细胞治疗(ACT)的第一个障碍。
另一方面，TCR的高亲和力伴随着自身免疫反应，当患者接受ACT治疗时，有时会导致严重的不良事件。据报道，采用超生理、高亲和力的TCR，ACT不能提高疗效。相反，少量的MHC-肽复合物可以实现高TCR占用，因为单个复合物可以串联并触发数百个TCR。
总之，这表明一种模型，其中TCR的理想亲和力应提供足够长时间的相互作用，以实现近端信号的传递，但亲和力也应适当降低，以分离并允许尽可能多的TCR遇到MHC-肽复合物。
scFv亲和力对CAR-T细胞功能反应的影响仍不完全清楚。一般来说，与天然TCR的亲和力相比，scFv构建的CAR具有更高的亲和力。因为大多数TAA在肿瘤中高表达，而在正常组织中低表达，所以增加CAR的亲和力可能导致由靶向/非肿瘤效应引起的严重副作用的风险。因此，必须考虑刺激阈值，以获得CAR-T细胞活化的最佳特异性。
与天然T细胞类似，CAR-T细胞可以以连续的方式杀死多个靶细胞。当用CAR而不是TCR刺激肿瘤细胞时，肿瘤细胞可以被更快地消除，因为CAR可以比TCR更快地从垂死的肿瘤细胞中解离出来。因此，增加CAR-T细胞的亲和力可能会减少/阻止持续杀伤，促进T细胞衰竭，并减少中枢记忆和效应表型T细胞的产生和持久性，或通过激活和诱导细胞死亡来增加T细胞的损失。
实体肿瘤靶抗原的筛选
ACT的关键是选择靶抗原以提供足够的疗效并使毒性最小化。一些靶向肿瘤特异性抗原的Cars在临床实践之前已经被开发出来，包括靶向异常糖基化癌基因的CARs，如MUC1的Tn糖形式，肿瘤特异性激活形式的整合素，以及临床实践中的肿瘤特异性转录变体EGFRvIII，如靶向胶质母细胞瘤的CARs。
在缺乏更多肿瘤特异性靶点的情况下，CAR-T细胞疗法可能继续靶向也在正常组织中表达的实体瘤TAA。事实上，大多数正在进行的CAR-T细胞治疗实体瘤的临床试验都是针对这种TAA的。
了解正常组织是否表达抗原及其表达水平对预测潜在毒性非常重要。
基于基因表达(RNA测序或微阵列)或免疫组织化学(IHC)，可以获得正常组织中抗原表达的几个公共数据库。然而，这些技术包含局限性和缺陷。对于基因表达分析，关键细胞表达的非常罕见的抗原可能被低估。此外，可能无法区分表达的基因是来自组织还是浸润细胞。此外，假阳性和假阴性是尚未解决的问题，IHC对低表达抗原的敏感性可能不足以选择实体瘤的CAR靶点。
单细胞RNA测序等新技术可以提供更准确的表达谱，使研究人员能够更好地预测新CAR-T细胞的疗效和毒性。
扩大CAR-T细胞治疗窗口的策略
“治疗窗”是药物毒理学的术语，定义为疗效和毒性之间的一系列剂量，达到最高的治疗益处，且不引起不可接受的毒性。虽然工程细胞的药代动力学与传统药物有很大不同，但将治疗窗的概念应用于ACT领域来优化治疗方法将是有价值的。
图A:最小有效剂量(MED)和最大耐受剂量(MTD)之间的范围；
图B:在CAR-T细胞治疗中，仅在肿瘤细胞上表达的靶向抗原或仅在非关键组织上表达的抗原扩大了治疗窗，因为它不会对重要组织产生直接毒性；
图C:靶向关键正常组织/细胞中表达的抗原通过减少MTD缩小了治疗窗口。
治疗窗的确定不能仅基于抗原表达谱来解决。例如，即使在肿瘤和正常组织的抗原表达非常不同的情况下，其中抗原在肿瘤中以更高的密度表达，由于其固有的免疫抑制，肿瘤可能仍然比正常组织对CAR-T细胞更具抗性。正常组织中不存在的TME。在这种情况下，肿瘤抑制T细胞浸润或诱导T细胞功能障碍将通过增加MED来减少CAR-T细胞的治疗窗。
鉴于目前尚未发现真正的肿瘤特异性靶表面抗原，TAA可能是我们在可预见的未来唯一合理的目标。因此，对于实体肿瘤的治疗，有必要制定策略来扩大CAR-T细胞治疗的治疗窗口。
扩大治疗窗的可能方法包括：(1)优化CAR密度、亲和力和诱导；(2)优化免疫突触的形成；(3)综合治疗；(4)CAR-T细胞和治疗剂的局部递送；(5)诱导目标抗原的表达；(6)其他修改。
优化汽车密度、亲和力和诱导
虽然提高CAR的亲和力使得识别不依赖于靶密度的抗原成为可能，但这种作用可能会引起严重的副作用，即靶上/瘤外毒性，并降低持续杀伤靶肿瘤的能力。
因此，制定合理的策略来确定理想的汽车亲和力至关重要。
利用轻链交换技术构建亲和力调节的scFv是测定CAR最佳亲和力最可行的方法之一。据报道，CAR-T细胞的亲和力不一定必须高于某一阈值，或者更重要的是，通过产生对同一表位具有不同亲和力的CAR，并鉴定这些表位特异性CAR-T细胞的最低亲和力，显示出最大的细胞裂解、增殖和安全潜力。
除了改变scFv的亲和力外，调节表面CAR的表达水平是诱导理想CAR信号转导的重要因素。CAR-T细胞的功能受CAR密度和靶抗原密度控制，任何一个的低表达都会导致CAR-T细胞的功能和敏感性受限。
另一方面，CAR结构和高CAR密度可能导致CAR的持续信号转导(紧张信号)，进而通过增加T细胞分化、耗竭和激活诱导的细胞死亡(AICD)而诱发较差的抗肿瘤效果和体内T细胞植入。因此，提高CAR密度，同时保持表达低于诱导紧张信号所需的阈值，可以诱导足够的抗肿瘤功效，并保持每个靶抗原和CAR构建体的安全潜力。
此外，结合的抗原可以被肿瘤细胞上的两种不同的抗原识别。(1)“与”逻辑门控制CAR: CAR-T细胞只有在两种独立的所需抗原同时被识别时才能被最佳激活。(2)“或”逻辑门CAR: CAR-T细胞通过表达具有串联抗原结合结构域的两个CAR或单个CAR，识别两种不同抗原中的任何一种，以驱动完整的信号转导。其中，“与”逻辑车的工程化T细胞可以实现更特异、更安全的靶向，“或”逻辑车有潜力克服靶抗原表达低和靶抗原丢失导致的肿瘤逃逸。
另一个有吸引力的平台是使用衔接分子开发“通用”CAR，以克服抗原表达中的肿瘤异质性，并使CAR-T细胞的激活更有条件。该平台在临床应用中的潜在问题
如上所述，CAR比TCR的靶眼结构更杂乱，但具有良好的组织，其特征是Lck排列的多灶模式、肌动蛋白环减少和LFA-1扩散分布。与TCR IS相比，CAR IS的显著能力实际上是瞬间诱导近端信号转导和细胞毒颗粒的快速递送，这是由MTOC更快迁移到CAR IS介导的。这些优点使得CAR-T细胞能够从被破坏的肿瘤细胞中快速解离，并介导有效的持续杀伤。
最近，一些研究报告了关于汽车设计如何影响IS形成的重要发现。有研究利用CD28或4-1BB共刺激结构域构建的CD19特异性CAR来检测CAR的质量，确定含CD28加4-1BB的第三代CAR优于基于CD28的第二代CAR，包括IS的结构、信号和功能。与双特异性CAR-T细胞相比，特异于两种胶质瘤相关抗原HER2和IL13R2的CAR显示出显著更高的F-肌动蛋白积累和MTOC极化增加。
CAR的结构特征正在被阐明，它的调控将是CAR-T细胞治疗的一个很好的选择。已经有一些尝试通过免疫调节药物(酰亚胺)来改善CAR IS，例如来那度胺-沙利度胺的合成衍生物。来图丁胺通过增加肌动蛋白的积累来提高CAR的疗效，这是一种具有增强CAR活性潜力的联合治疗。
综合疗法
联合治疗是一种很有前途的策略，通过克服肿瘤异质性和扩大治疗窗口来促进CAR-T细胞治疗实体肿瘤。
溶瘤病毒(OVs)是治疗实体肿瘤的有前途的药物。OV专门针对肿瘤细胞，但对正常细胞没有影响，这促进了直接的肿瘤溶解并激活了免疫系统。此外，可以对OV进行遗传修饰，以在TME选择性表达治疗性转基因。OV在局部表达治疗性转基因的同时恢复抗肿瘤免疫反应的能力为其与CAR-T细胞疗法的组合提供了合理的理由。
其他组合方法包括与对4-1BB共刺激受体特异的激动剂抗体的组合，其可以直接激活CAR-T细胞，也可以减少宿主免疫抑制免疫细胞，如Tregs或MDSC。
CAR-T细胞和治疗剂的局部递送
CAR-T细胞的全身性递送可能受到实体瘤可及性的限制，这也涉及安全性问题。因此，直接施用(局部施用)到肿瘤部位是CAR-T细胞递送的解决方案。另一种方法是设计CAR-T细胞，使其仅在肿瘤部位或主要在肿瘤部位发挥功能。
为了克服免疫TME、细胞因子和趋化因子的局部递送，如IL-18和IL-12、CCL19和IL-7的组合，或表达检查点阻断剂的CAR-T细胞，可以帮助克服TME对T细胞浸润和功能的阻碍。临床前模型已经证明，这些方法具有增强的治疗效果，并且可以避免全身不良事件。
诱导靶抗原表达
如前所述，靶抗原密度可以控制CAR-T细胞治疗的疗效。
此外，靶抗原的丢失或下调是肿瘤逃逸的主要原因。诱导或再诱导靶细胞上的抗原表达可能是扩大治疗窗口的一种有吸引力的方法。
据报道，亚致死剂量的辐射可以诱导肿瘤细胞中TAA(如间皮素和癌胚抗原)的表达。此外，表观遗传控制还可以调节靶抗原的表达。例如，抗甲基化药物氮杂胞苷(5-AZA)可以在治疗后重新诱导淋巴瘤细胞中的CD20表达，包括在用靶向CD20的利妥昔单抗治疗后。
其他修改
配备自杀系统的CAR-T细胞，如诱导型caspase-9 (iCas9)或截短EGFR的共表达，将增强CAR-T细胞的安全性。这些系统可以通过诱导内源性细胞凋亡或外源性抗体介导的细胞耗竭来诱导CAR-T细胞的耗竭。
诱导型CAR系统，包括TET诱导系统，可以通过药物诱导来控制CAR的表达。
合成缺口系统(synNotch)为CAR-T细胞的多样化和灵活性提供了另一个有吸引力的平台。SynNotch受体可以允许在抗原识别期间将定制的应答程序添加到T细胞中。例如，当识别抗原时，synNotch可以驱动定制的细胞因子分泌、有偏向的T细胞分化或治疗有效载荷(如抗体)的局部递送。
标签
用CAR-T细胞治疗实体瘤是复杂的和多因素的，并且它比靶向治疗B细胞白血病和非霍奇金淋巴瘤的CD19具有更窄的治疗窗。
尽管有越来越多的临床研究，但除了脑室内递送IL13R2CAR的胶质母细胞瘤外，几乎没有明显的疗效。在这种情况下，确立扩大治疗窗口的策略就显得非常重要。
生物学、TME和CAR-T细胞生物学还有很多未知数。幸运的是，解决这些问题的强大工具，如生物信息学、质谱蛋白质组学、大规模细胞计数和单细胞RNA测序，将使我们能够获得关于肿瘤、TME成分和免疫细胞的准确信息。
此外，基因编辑技术的成熟，如CRISPR/Cas9系统，或合成生物学，如synNotch系统，将能够帮助灵活设计T细胞，有利于实体肿瘤CAR-T细胞治疗的突破。
最后，当新的CAR-T细胞疗法首次应用于患者时，报道了几例意想不到的严重毒性。不幸的是，目前的技术不允许我们预测临床环境中的所有毒性。因此，目前只有临床试验才能揭示ACT的安全性和有效性信息。未来，可以预测毒性的临床前模型的不断开发和改进，以及临床试验的合理规划和实施，对于CAR-T细胞治疗的进一步发展至关重要。
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