要害质量参数是单抗仿造药研发的标杆，包罗糖基化润色、聚体、电荷异质性等，此中如糖基化润色对单抗的生物活性、免疫原性、药物代谢动力学、构象、稳定性及溶解度存在紧张的影响。细胞培养进程中细胞所处情况，如pH、温度、渗透压、溶氧等参数会影响到单抗糖基化显示，本文便文献中对渗透压、培育工夫跟溶氧等培育控制参数，和温度、剪切力跟培育形式对糖基化影响的研讨停止了扼要总结。
渗透压跟培育工夫
系统中渗透压的调节可以经由过程向根底培养基或补料培养基中参加NaCl实现，从而考查渗透压对细胞发展、卵白产量及质量的影响。Efren Pacis团队将根底培养基渗透压离别配制为300、330、360跟400 mOsm/kg，补料培养基的渗透压为750跟1250 mOsm/kg，并取分歧时间段的样品停止检测，进而便渗透压及培育工夫对卵白糖基化的影响停止研讨，试验进程中采取的为CHO细胞。
以渗透压为300 mOsm/kg的根底培养基跟750 mOsm/kg的补料培养基为对照组，如图1所示，D22地利对照组的Man5为15%，而当根底培养基的渗透压为400 mOsm/kg时其Man5为18%；类似前提下，而将补料的渗透压增长到1250 mOsm/kg时，Man5的比例增长到23-27%。而G0F的显示则恰好相反，渗透压降低时会招致更低的G0F比例，分歧渗透压前提下G1F的差异性并不大。Efren Pacis的试验中，跟着渗透压的增长，Man5增长，G0F降低，G1F颠簸较小，研讨职员正在CHO-B、C、D跟E中均发明了近似的环境。
图1 分歧根底培养基(300、330、360跟400 mOsm/kg)跟补料培养基(750跟1250 mOsm/kg)时的糖基化显示(a. Man5; b. G0F; G1F) (来源于参考文献1)
另外，从图1中借可以看出，跟着培育工夫的增长，Man5呈上升趋向，而G0F跟G1F均显示为降低趋向，那能够与卵白的一些自发过程有关。并且，下渗透压环境下细胞的发展还会遭到抑止，卵白的产量也会降低。因为人类自身细胞抒发的卵白抗体的下甘露糖糖型(Man5-9)普通正在5%摆布，畸形环境下没有采用下渗透压的培育前提。
为注释渗透压影响糖基化的机理，研讨职员对GnT-1 (N-乙酰氨基葡萄糖转移酶I，调控Man5与其他糖类链接)的mRNA程度停止了检测。离别与分歧渗透压实验组D3、7、12跟14的样品停止测定，检测结果显示分歧渗透压组GnT-1的mRNA差异性很小，渗透压对Man5程度的影响能够是经由过程影响GnT-1酶活或是影响mRNA的转录。
溶氧(Dissolved Oxygen，DO)
作为细胞培养的一个紧张参数，普通试验范围或出产范围中经常设置为40%，但也会存在个例。有学者认为将DO规模设置正在25-50%时是最优的细胞培养前提，即便细胞能够会缺氧；而将溶氧保持正在过高水平时会加速过氧化物的造成，对DNA、卵白跟脂质等发生毁伤，也会招致细胞发展变差。
有时会由于传质后果好或细胞对氧须要高而将溶氧设置很下，如60-80%，且没有思量如许的参数设置是不是可以真正的解决问题，先相识下溶氧对单抗糖基化的影响。学者关于DO对卵白糖基化影响的研讨成果也是没有同等的，如有学者研讨评释低水平DO会降低半乳糖糖基化，而其他研讨则指出DO不会影响半乳糖化，可见DO对糖基化的影响借与细胞系等因素有关。
VeronicaRestelli等正在2.4/4L的培育系统中研讨了3、10、50(对照组)、100跟200%的DO对细胞发展、卵白产量及糖基化的影响，采取CHO-K1细胞系分解促红细胞生成素(EPO)。
VeronicaRestelli起首用弱阴离子交流柱将EPO停止离散，然后再对失掉的卵白停止唾液酸化水平的剖析研讨。其检测成果如表1所示，正在所得样品中唾液酸化程度根本皆正在83-93%，平均水平为89%。除100% DO的16.37%的非唾液酸化中，其他程度的DO的非唾液酸化基本一致。对EPO分歧布局类型(复合型、杂合型跟下甘露糖型)的糖基化研讨，Veronica Restelli采取了HPLC的检测方式，结果表明DO的分歧设定值对其不影响。
表1 DO对EPO唾液酸化的影响
分歧的DO设定(3、10、50、100跟200%)下卵白的岩藻糖化规模为75-81%，如图2所示，当DO为50%或100%时岩藻糖程度最高为80%摆布；而当DO为3、10跟200%时，卵白的岩藻糖水均匀正在75-76%规模内。即当DO为50%或100%时，岩藻糖化程度最高，跟着DO的增长或降低而渐渐降低。整体来说，Veronica Restelli的试验研讨中EPO的糖基化润色正在较宽的DO规模内变更较小，近似的情况下试验中利用的细胞株对DO的耐受性下。
Kunkel等研讨了DO对IgG半乳糖化的影响，其对三个梯度的DO (10、50、100%)停止了试验，结果表明进步DO浓度可以增进IgG的半乳糖化，如图3所示。当DO为10%的G2的含量为12%，而当DO为100%时G2的含量进步到30%，G1的变更随DO的转变并没有较着。
DO对卵白糖基化影响的作用机制借没有明白，有学者认为DO降低会细胞对UDP-Gal(Uridine diphosphate galactose，尿苷二磷酸半乳糖)的利用率，从而进而进入到高尔基体的前体物降低；另有的认为后期露二硫键的重链化合物会极大的影响半乳糖化进程。
温度(Temperature)
生物反应器温度是节制细胞发展及卵白产量的紧张手腕，细胞培养进程中最好培育温度(Temperature T)普通为37℃摆布。培育后期37℃的培育温度以取得较下的细胞密度，而当细胞密度濒临Peak时，降低温度至30℃摆布是延伸对数期的常用手腕，以此可以失掉较下的卵白产量。
可是Temp Shift不单单可以进步卵白产量，有研讨发明高温前提下细胞内的蛋白酶及其他毒性酶的活性会降低，从而正在必然水平上进步卵白的质量，上面便Temp Shift对糖基化影响的相关研讨停止扼要概述。
Michael等对分歧的Temp Shift工夫(初期、中期跟晚期)对唾液酸含量的影响停止了研讨，如图1所示，降温工夫越晚细胞的Peak VCD越高，可是降温工夫对唾液酸含量的影响简直可以疏忽。当培育温度正在初期(D3)、中期(D4)跟晚期(D5)停止调节时，研讨与D11天样测得的唾液酸含量离别为0.98、0.98跟0.92，另外正在三种分歧计划下的D10跟D12天的唾液酸含量基本一致。
即正在Michael的研讨系统中，D3、D4跟D5调节培育温度对唾液酸不较着的影响，但会影响到细胞的显示，此外研讨职员并不已停止Temp Shift的试验对比数据，是以Temp Shift对系统中卵白糖基化影响的研讨并没有完全。虽然Temp Shift对唾液酸总量的影响没有较着，但其对唾液酸的两种情势Neu5Gc跟Neu5Ac的比重有较着影响。当推延Temp Shift工夫时，Neu5Gc程度明显降低了29-59%，即影响二者的彼此转换，但对整体的唾液酸量不影响。
图1 分歧的Temp Shift工夫对细胞发展(左)及卵白唾液酸化(左)的影响(图片来源于参考文献4)
正在Mariela的另一篇文章中其借研讨了CHO-K1-hGM-CSF细胞系关于分歧培育温度，37℃跟33℃，对细胞发展、hGM-CSF产量及其糖基化的影响。正在实验组中，研讨职员将一组试验一直保持正在37℃停止培育，而另一组是当细胞密度濒临Peak时降低温度到33℃。
研讨发明，高温(33℃)对细胞的活率保持有利，而且33℃时hGM-CSF的最高产量是37℃下hGM-CSF最高产量的6倍。因为培育情况的转变对卵白的质量有紧张的影响，是以研讨职员便两种温度下hGM-CSF糖基化停止了测定，将hGM-CSF纯化跟来唾液酸化后对其寡糖(oligosaccharide)布局停止测定，检测成果如表1所示。hGM-CSF来唾液酸化后的岩藻糖化不根本连结稳定(16.0→14.2、48.7→50.7%、35.3→35.1%) ；而其来唾液酸后的寡糖布局正在温度调节后不较着变更(18.7→17.0%、32.0→33.4%、32.5→34.0%、16.8→15.6%)，也便默示调节温度对hGM-CSF糖链终端的唾液酸化程度不较着影响。即正在Mariela的试验研讨中，将培育温度从37℃(细胞发展阶段)降低至33℃(卵白抒发阶段)可以进步细胞的发展形态，增长hGM-CSF卵白的产量，同时对hGM-CSF的糖基化影响幽微。
表1 分歧温度时hGM-CSF的寡糖布局比力
(图表来自于参考文献5)
剪切力(Shear stress)
细胞培养中剪切力可以被认为是分歧流速的、两个层面的培养液间的摩擦力，细胞正在这股“力”作用下能够会提早殒命或消融。有研讨报导剪切力可以对卵白糖基化形成影响，实验室小规模培育时剪切力对细胞显示的影响并没有较着，而跟着培育范围的扩展又或是细胞的敏感度培育，工艺转移或是缩小时剪切力成为一个不能不思量的因素。
搅拌转速的转变可以直观天影响剪切力，Senger等研讨发明下剪切力可以降低tPA上Asn184位点的糖链长度，进而影响卵白糖基化。Senger研讨过程中将tPA的糖基化分为两种类型，Type I(完整糖基化)跟TypeII(部门糖基化)，经由过程Kinetic剖析得出下剪切力作用下会发生两个成果：tPA卵白的产量增长；Type II型卵白比率增长，Type I型卵白比率降低，即卵白整体糖基化比率降低。剖析其缘故原由，Senger认为下剪切力形成细胞的提早殒命或消融，招致tPA正在ER(糖基化进程先产生于内质网「ER」，再到高尔基体中进一步加工)的停留时间过短，部门卵白借已实现糖基化进程便曾经被开释到培育情况中，糖基化比率降低。
培育形式
细胞培养形式可分为批培育(Batch)、补料分批培养(Fed-batch)、稀释补料分批培养(Concentrated Fed-batch)跟灌流培育(Perfusion)等，现阶段使用最多的为Fed-batch形式，Perfusion连续培养形式也逐渐进入人们眼中，培育形式的改善次要集合于节制本钱，其对细胞显示及蛋白质量的影响也是须要思量的因素。
学者Kunkel等正在细胞培养形式(Batch Fed-batch Perfusion)对细胞发展及蛋白质量影响的研讨中发明，培育形式的转变对卵白糖基化表型存在较着的影响，其采取细胞CHO DG44出产SEAP停止了相关试验。从整体的糖基化比率来看，Kunkel发明与Batch跟Fed-batch比拟，Perfusion培育形式出产的卵白糖基化比率最高，其能够与培育体系中谷氨酰胺浓度有关，Batch跟Fed-batch培育时低浓度的谷氨酰胺限定了糖基化的位点。
而关于下甘露糖型，其正在Batch、Fed-batch跟Perfusion形式中的比率依次降低，这是因为培育工夫长短不一、细胞存活工夫分歧(PerfusionFed-batchBatch)，正在Batch培育中细胞过早殒命招致卵白提早从高尔基体中开释，而已实现畸形的糖基化润色。而卵白SEAP的唾液酸化比率则呈相反的环境，Batch、Fed-batch跟Perfusion形式中的唾液酸化比率离别为17.6%、31.6%跟50.9%，关于一点作者的注释是较早的细胞殒命或消融使细胞质中的唾液酸酶得以开释，从而将糖链末尾的唾液酸降解，从而削减了唾液酸化比率。
参考文献：
1.Effectsof Cell Culture Conditions on Antibody N-linked Glycosylation—What Affects High Mannose 5 Glycoform
2.The Effect of Dissolved Oxygen on the Production and the Glycosylation Profile of Recombinant Human Erythropoietin Produced From CHO Cells
3.Optimisation of the cellular metabolism of glycosylation for recombinant proteins produced by mammalian cell systems
4.Effects of Culture Conditions on N-Glycolylneuraminic Acid (Neu5Gc) Content of a Recombinant Fusion Protein Produced in CHO Cells
5.Temperature Reduction in Cultures of hGM-CSF-expressing CHO Cells: Effect on Productivity and Product Quality
6.Optimal and consistent protein glycosylation in mammalian cell culture