最近，纪念斯隆-凯特林癌症中心的米歇尔萨德兰(Michel Sadelain)及其团队在《自然医学》杂志上发表了一项重磅研究，指出在CD3链中使用一个ITAM结构域而不是全长可以获得更强的肿瘤抑制活性，这可能为未来的汽车结构设计开辟了新思路。
嵌合抗原受体(CAR)是一种工程化细胞表面受体，一般表达于T细胞上，介导工程化T细胞对特定靶肿瘤细胞的杀伤作用。其中，针对CD19(一种B细胞表面标志蛋白)的两种CAR-T细胞疗法Kymriah(诺华)和Yescarta(吉利德)已于2017年获得FDA批准，开创了CAR-T细胞疗法的元年。
纵观CAR-T的发展史，第一代CAR-T只有CD3链(ITAM，免疫受体酪氨酸基激活基序)；第二代CAR-T增加了CD28或4-1BB和其他共刺激结构域(CM1)，如Kymriah和Yescarta；在第三代CAR-T中，增加了两个共刺激结构域(CM1和cm2)如CD28和4-1BB。第四代CAR-T在第二代的基础上增加了共表达的细胞因子，如IL-12；第五代CAR-T也是在第二代的基础上，增加了激活其他信号通路的共刺激结构域，如IL2-2R细胞内结合SAAT3/5的结构域。一代又一代，各种各样的结构设计赋予了CAR-T细胞疗法无限的生命力和未来(图1)。
图1:car-t细胞结构设计的发展历史
以上五代不同设计的CAR-T都是不同信号分子结构域的工程化组合结构，但仍局限于直接使用原结构域。例如，使用CD3链信号基序的天然序列(包括3个ITAM)，或使用CD28，4-1BB细胞内信号结构域的原始序列，该结构域本身没有被工程化。尤其是CAR设计中最重要的CD3结构域，几乎都是含有三个ITAM结构域的胞内全长序列。然而，最近，纪念斯隆-凯特林癌症中心的米歇尔萨德兰(Michel Sadelain)及其团队在《自然医学》(Nature Medicine)上发表了一项重磅研究，指出在CD3链中使用一个ITAM结构域而不是全长可以获得更强的肿瘤抑制活性，这可能为未来的汽车结构设计打开一种新的思路。
Michel Sadelain及其团队针对使用CD28-CD3的CAR-T细胞容易出现T细胞耗竭的现象，提出了可能是由于CD3所含的三个ITAM结构域过度激活T细胞的假说。因此，基于CD19-CD28-CD3的经典CAR-T结构，他们设计了三个突变的CD3结构域，并分别突变和灭活了一个或两个ITAM结构域(图2)。结果在小鼠肿瘤模型中，发现具有活性ITAM-1结构域的CAR-T细胞(1XX)具有更强的抗肿瘤活性和更长的耐受性。然而，保留ITAM-3结构域活性的CAR-T细胞(XX3)的抗肿瘤活性最差(图3)。
图2:不同CD3突变的CD19-CD28-CD3结构，通过点突变技术消除了ITAM结构域的活性。
图3:小鼠肿瘤模型评估CAR-T细胞抑制肿瘤细胞的能力。
基于上述实验结果，研究人员怀疑ITAM-3结构域本身微弱的信号转导能力是否导致了只保留ITAM-3结构域活性的CAR-T细胞效果最差？因此，他们设计了仅含ITAM-1或ITAM-3的CAR，发现两者都能产生与经典CAR-T相当且更强的肿瘤抑制活性(图4)。这些结果表明，在CD19-CD28-CD3的结构中，ITAM的数量和位置对CAR-T细胞抑制肿瘤的能力有重要影响，ITAM越靠近跨膜区，信号传递的能力越强。
图4:截短的CD3 CAR结构的设计和在小鼠中肿瘤抑制能力的评估
在TCR信号转导中，CD3的激活基序ITAM起着关键作用。简单地说，当TCR-CD3与MHC肽结合时，一种叫做Lck的酪氨酸激酶磷酸化CD3的ITAM结构域。磷酸化的ITAM募集并结合ZAP-70蛋白。募集的ZAP-70也被Lck磷酸化，与Lck一起磷酸化其他蛋白，传导T细胞激活信号(图5)。
图5:与5:TCR-CD3信号通路相关的主要蛋白质
在T细胞的自然活化过程中，CD3的三种ITAM缺一不可，但为什么CAR-T细胞的CD19-CD28-CD3结构中只有一种ITAM反而能产生更强的肿瘤抑制活性？Michel Sadelain等人通过全基因组转录图谱分析发现，CAR-T细胞的经典结构更接近效应T细胞，CAR-T细胞的1XX结构更接近记忆T细胞，肿瘤抑制活性最差的CAR-T细胞的XX3结构更接近初始T细胞(图6)。因此，在体内，1XX结构的CAR-T细胞同时具有效应T细胞和记忆T细胞，具有更持久的肿瘤抑制活性也就不足为奇了。
图6:三种CAR-T细胞的表型分析
最后，作者认为在以CD28为共刺激域的汽车设计中，降低ITAM显然具有更强的优势。然而，在以4-1BB为共刺激域的设计中，降低或增加ITAM是否更有效仍需实验验证。但最终目的是找到最合适的T细胞活化程度。过多或过少都不能发挥最强的抑瘤活性。基于这种设计的临床实验也在进行中，我们预计未来会有好的数据发表。
参考资料：
1.CAR激活潜能的校准可指导T细胞的命运和治疗能力。
2.募集到T细胞受体-CD3复合物的选定信号蛋白。
3.教老狗新招：下一代汽车T细胞。